Wat is CRISPR?

CRISPR-technologie is een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel voor het bewerken van genomen. Het stelt onderzoekers in staat om eenvoudig DNA-sequenties te wijzigen en de genfunctie te wijzigen. De vele mogelijke toepassingen zijn onder meer het corrigeren van genetische defecten, het behandelen en voorkomen van de verspreiding van ziekten en het verbeteren van gewassen. De belofte ervan roept echter ook ethische bezwaren op.

In populair gebruik is "CRISPR" (uitgesproken als "crisper") een afkorting voor "CRISPR-Cas9." CRISPR's zijn gespecialiseerde stukjes DNA. Het eiwit Cas9 (of 'CRISPR-geassocieerd') is een enzym dat werkt als een moleculaire schaar die in staat is om DNA-strengen door te knippen.

CRISPR-technologie werd aangepast van de natuurlijke afweermechanismen van bacteriën en archaea (het domein van eencellige micro-organismen). Deze organismen gebruiken CRISPR-afgeleid RNA en verschillende Cas-eiwitten, waaronder Cas9, om aanvallen door virussen en andere vreemde lichamen te voorkomen. Ze doen dit voornamelijk door het DNA van een buitenlandse indringer in stukken te hakken en te vernietigen. Wanneer deze componenten worden overgebracht naar andere, meer complexe organismen, is het mogelijk om genen te manipuleren of te 'bewerken'.

Tot 2017 wist niemand echt hoe dit proces eruit zag. In een paper gepubliceerd op 10 november 2017 in het tijdschrift Nature Communications, liet een team van onderzoekers onder leiding van Mikihiro Shibata van Kanazawa University en Hiroshi Nishimasu van de University of Tokyo zien hoe het eruit ziet als een CRISPR voor de allereerste tijd. [Een adembenemende nieuwe GIF laat zien hoe CRISPR DNA kauwt]

CRISPR-Cas9: De belangrijkste spelers

CRISPRs: "CRISPR 'staat voor' clusters van korte palindrome herhalingen met regelmatige tussenruimten '. Het is een gespecialiseerd gebied van DNA met twee verschillende kenmerken: de aanwezigheid van nucleotideherhalingen en spacers. Herhaalde sequenties van nucleotiden - de bouwstenen van DNA - worden verspreid over een CRISPR Spacers zijn stukjes DNA die worden afgewisseld tussen deze herhaalde sequenties.

In het geval van bacteriën zijn de spacers afkomstig van virussen die eerder het organisme hebben aangevallen. Ze dienen als een geheugenbank, waardoor bacteriën de virussen kunnen herkennen en toekomstige aanvallen kunnen afweren.

Dit werd voor het eerst experimenteel gedemonstreerd door Rodolphe Barrangou en een team van onderzoekers bij Danisco, een bedrijf in voedingsingrediënten. In een paper uit 2007, gepubliceerd in het tijdschrift Science, gebruikten de onderzoekers Streptococcus thermophilus bacteriën, die veel voorkomen in yoghurt en andere zuivelculturen, als hun model. Ze merkten op dat na een virusaanval nieuwe spacers werden opgenomen in de CRISPR-regio. Bovendien was de DNA-sequentie van deze spacers identiek aan delen van het virusgenoom. Ze manipuleerden ook de spacers door ze eruit te halen of nieuwe virale DNA-sequenties in te brengen. Op deze manier konden ze de weerstand van de bacterie tegen een aanval door een specifiek virus veranderen. Zo bevestigden de onderzoekers dat CRISPR's een rol spelen bij het reguleren van bacteriële immuniteit.

CRISPR-RNA (crRNA): Zodra een spacer is ingebouwd en het virus opnieuw aanvalt, wordt een deel van de CRISPR getranscribeerd en verwerkt tot CRISPR RNA, of "crRNA". De nucleotidesequentie van de CRISPR fungeert als een sjabloon om een ​​complementaire sequentie van enkelstrengs RNA te produceren. Elke crRNA bestaat uit een nucleotideherhaling en een spacergedeelte, volgens een recensie uit 2014 door Jennifer Doudna en Emmanuelle Charpentier, gepubliceerd in het tijdschrift Science.

Cas9: Het Cas9-eiwit is een enzym dat vreemd DNA doorsnijdt.

Het eiwit bindt typisch aan twee RNA-moleculen: crRNA en een ander genaamd tracrRNA (of "trans-activerende crRNA"). De twee begeleiden Cas9 vervolgens naar de doelsite waar hij zal snijden. Deze uitgestrektheid van DNA is complementair aan een stuk van 20 nucleotiden van het crRNA.

Met behulp van twee afzonderlijke regio's, of 'domeinen' op zijn structuur, snijdt Cas9 beide strengen van de dubbele DNA-helix door, waardoor een zogenaamde 'dubbelstrengige breuk' ontstaat, volgens het Science-artikel uit 2014.

Er is een ingebouwd veiligheidsmechanisme dat ervoor zorgt dat Cas9 niet zomaar ergens in een genoom snijdt. Korte DNA-sequenties die bekend staan ​​als PAM's ("protospacer aangrenzende motieven") dienen als tags en zitten naast de doel-DNA-sequentie. Als het Cas9-complex geen PAM naast zijn doelwit-DNA-sequentie ziet, zal het niet knippen. Dit is een mogelijke reden dat Cas9 de CRISPR-regio nooit aanvalt met bacteriën, volgens een recensie uit 2014 gepubliceerd in Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 als hulpmiddel voor het bewerken van genoom

De genomen van verschillende organismen coderen voor een reeks berichten en instructies binnen hun DNA-sequenties. Genoombewerking omvat het veranderen van die sequenties, waardoor de berichten worden gewijzigd. Dit kan worden gedaan door een snee of breuk in het DNA in te brengen en de natuurlijke DNA-herstelmechanismen van een cel te misleiden om de gewenste veranderingen te introduceren. CRISPR-Cas9 biedt een manier om dit te doen.

In 2012 werden twee cruciale onderzoekspapers gepubliceerd in de tijdschriften Science en PNAS, die hielpen om bacteriële CRISPR-Cas9 te transformeren in een eenvoudige, programmeerbare tool voor het bewerken van genoom.

De onderzoeken, uitgevoerd door afzonderlijke groepen, concludeerden dat Cas9 kan worden gericht op het knippen van elk DNA-gebied. Dit kan worden gedaan door simpelweg de nucleotidesequentie van crRNA te veranderen, dat zich bindt aan een complementair DNA-doelwit. In het Science-artikel uit 2012 hebben Martin Jinek en zijn collega's het systeem verder vereenvoudigd door crRNA en tracrRNA samen te voegen tot één "gids-RNA". Genoombewerking vereist dus slechts twee componenten: een gids-RNA en het Cas9-eiwit.

"Operationeel ontwerp je een stuk van 20 [nucleotide] basenparen die passen bij een gen dat je wilt bewerken", zegt George Church, een professor in de genetica aan de Harvard Medical School. Er wordt een RNA-molecuul geconstrueerd dat complementair is aan die 20 basenparen. Church benadrukte het belang om ervoor te zorgen dat de nucleotidesequentie alleen in het doelgen wordt gevonden en nergens anders in het genoom. "Dan zal het RNA plus het eiwit [Cas9] - als een schaar - het DNA op die plek knippen, en idealiter nergens anders", legt hij uit..

Zodra het DNA is gesneden, treden de natuurlijke herstelmechanismen van de cel in werking en werken ze aan het introduceren van mutaties of andere veranderingen in het genoom. Dit kan op twee manieren gebeuren. Volgens het Huntington's Outreach Project aan Stanford (University) bestaat één reparatiemethode uit het weer aan elkaar lijmen van de twee delen. Deze methode, die bekend staat als "niet-homologe eindverbinding", heeft de neiging om fouten te introduceren. Nucleotiden worden per ongeluk ingebracht of verwijderd, wat resulteert in mutaties die een gen kunnen verstoren. Bij de tweede methode wordt de breuk verholpen door het gat op te vullen met een reeks nucleotiden. Om dit te doen, gebruikt de cel een korte DNA-streng als sjabloon. Wetenschappers kunnen het DNA-sjabloon van hun keuze aanleveren, waardoor ze elk gewenst gen inschrijven of een mutatie corrigeren.

Nut en beperkingen

CRISPR-Cas9 is de laatste jaren populair geworden. Church merkt op dat de technologie gemakkelijk te gebruiken is en ongeveer vier keer efficiënter is dan de vorige beste tool voor genoombewerking (TALENS genaamd).

In 2013 werden de eerste rapporten over het gebruik van CRISPR-Cas9 om menselijke cellen te bewerken in een experimentele setting gepubliceerd door onderzoekers van de laboratoria van Church en Feng Zhang van het Broad Institute van het Massachusetts Institute of Technology en Harvard. Studies met in vitro (laboratorium) en diermodellen van menselijke ziekten hebben aangetoond dat de technologie effectief kan zijn bij het corrigeren van genetische defecten. Voorbeelden van dergelijke ziekten zijn taaislijmziekte, cataract en Fanconi-anemie, volgens een overzichtsartikel uit 2016 gepubliceerd in het tijdschrift Nature Biotechnology. Deze onderzoeken effenen de weg voor therapeutische toepassingen bij mensen.

"Ik denk dat de publieke perceptie van CRISPR erg gericht is op het idee om genbewerking klinisch te gebruiken om ziekten te genezen", aldus Neville Sanjana van het New York Genome Center en een assistent-professor biologie, neurowetenschappen en fysiologie aan de New York University. "Dit is zonder twijfel een opwindende mogelijkheid, maar dit is maar een klein stukje."

CRISPR-technologie is ook toegepast in de voedings- en landbouwindustrie om probiotische culturen te ontwikkelen en om industriële culturen (bijvoorbeeld voor yoghurt) te vaccineren tegen virussen. Het wordt ook gebruikt in gewassen om de opbrengst, droogtetolerantie en nutritionele eigenschappen te verbeteren.

Een andere mogelijke toepassing is het creëren van gene drives. Dit zijn genetische systemen die de kans vergroten dat een bepaald kenmerk van ouder op nakomeling wordt overgedragen. Uiteindelijk verspreidt de eigenschap zich in de loop van generaties over hele populaties, volgens het Wyss Institute. Gene drives kunnen helpen bij het beheersen van de verspreiding van ziekten zoals malaria door de onvruchtbaarheid onder de ziektevector - vrouwtjes te vergroten Anopheles gambiae muggen - volgens het artikel in Nature Biotechnology uit 2016. Bovendien zouden gene drives ook kunnen worden gebruikt om invasieve soorten uit te roeien en resistentie tegen pesticiden en herbiciden om te keren, volgens een artikel uit 2014 van Kenneth Oye en collega's, gepubliceerd in het tijdschrift Science..

CRISPR-Cas9 is echter niet zonder nadelen.

"Ik denk dat de grootste beperking van CRISPR is dat het niet honderd procent efficiënt is", zei Church. Bovendien kunnen de efficiëntie van het bewerken van het genoom variëren. Volgens het Science-artikel van Doudna en Charpentier uit 2014 vond in een onderzoek in rijst het bewerken van genen plaats in bijna 50 procent van de cellen die het Cas9-RNA-complex ontvingen. Terwijl andere analyses hebben aangetoond dat, afhankelijk van het doel, de efficiëntie van het bewerken kan oplopen tot 80 procent of meer.

Er is ook het fenomeen van "off-target effecten", waarbij DNA wordt geknipt op andere plaatsen dan het beoogde doelwit. Dit kan leiden tot de introductie van onbedoelde mutaties. Verder merkte Church op dat zelfs als het systeem op het doel snijdt, er een kans is dat er geen nauwkeurige bewerking wordt gemaakt. Hij noemde dit 'genoomvandalisme'.

Grenzen stellen

De vele mogelijke toepassingen van CRISPR-technologie roepen vragen op over de ethische verdiensten en gevolgen van het knoeien met genomen.

In het Science-artikel van 2014 wijzen Oye en collega's op de mogelijke ecologische impact van het gebruik van gene drives. Een geïntroduceerde eigenschap kan zich via kruising buiten de doelpopulatie verspreiden naar andere organismen. Gene drives kunnen ook de genetische diversiteit van de doelgroep verminderen.

Het maken van genetische modificaties aan menselijke embryo's en voortplantingscellen zoals sperma en eieren staat bekend als kiembaanbewerking. Aangezien veranderingen in deze cellen kunnen worden doorgegeven aan volgende generaties, heeft het gebruik van CRISPR-technologie om kiembaanbewerkingen te maken een aantal ethische bezwaren opgeworpen..

Variabele werkzaamheid, afwijkende effecten en onnauwkeurige bewerkingen vormen allemaal veiligheidsrisico's. Bovendien is er veel dat de wetenschappelijke gemeenschap nog niet kent. In een artikel uit 2015, gepubliceerd in Science, merken David Baltimore en een groep wetenschappers, ethici en juridische experts op dat het bewerken van kiembaanlijnen de mogelijkheid van onbedoelde gevolgen voor toekomstige generaties verhoogt 'omdat er grenzen zijn aan onze kennis van menselijke genetica, gen-omgevingsinteracties, en de paden van de ziekte (inclusief de wisselwerking tussen de ene ziekte en andere aandoeningen of ziekten bij dezelfde patiënt). "

Andere ethische zorgen zijn genuanceerder. Moeten we veranderingen aanbrengen die fundamentele gevolgen kunnen hebben voor toekomstige generaties zonder hun toestemming? Wat als het gebruik van kiembaanbewerking verandert van een therapeutisch hulpmiddel naar een hulpmiddel voor verbetering van verschillende menselijke kenmerken??

Om deze zorgen weg te nemen, hebben de National Academies of Sciences, Engineering and Medicine een uitgebreid rapport samengesteld met richtlijnen en aanbevelingen voor genoombewerking.

Hoewel de National Academies aandringen op voorzichtigheid bij het bewerken van de kiembaan, benadrukken ze "voorzichtigheid is niet hetzelfde als een verbod". Ze bevelen aan dat kiembaanbewerking alleen wordt uitgevoerd op genen die tot ernstige ziekten leiden en alleen als er geen andere redelijke behandelingsalternatieven zijn. Ze benadrukken onder meer de noodzaak om te beschikken over gegevens over de gezondheidsrisico's en -voordelen en de noodzaak van continu toezicht tijdens klinische onderzoeken. Ze raden ook aan om families gedurende meerdere generaties op te volgen.

Recent onderzoek

Er zijn veel recente onderzoeksprojecten geweest rond CRISPR. "Het tempo van de ontdekkingen van fundamenteel onderzoek is explosief gestegen dankzij CRISPR", zegt biochemicus en CRISPR-expert Sam Sternberg, de groepsleider van technologieontwikkeling bij Caribou Biosciences Inc. uit Berkeley, Californië, die CRISPR-gebaseerde oplossingen voor de geneeskunde ontwikkelt. landbouw en biologisch onderzoek.

Hier zijn enkele van de meest recente bevindingen:

• In april 2017 publiceerde een team van onderzoekers in het tijdschrift Science dat ze een CRISPR-molecuul hadden geprogrammeerd om virussen, zoals Zika, te vinden in bloedserum, urine en speeksel..
• Op 2 augustus 2017 onthulden wetenschappers in het tijdschrift Nature dat ze met succes een hartaandoening in een embryo hadden verwijderd met behulp van CRISPR.
• Op 2 januari 2018 kondigden onderzoekers aan dat ze met CRISPR mogelijk schimmels en andere problemen die de chocoladeproductie bedreigen, kunnen stoppen om de planten resistenter te maken tegen ziekten..
• Op 16 april 2018 hebben onderzoekers CRISPR geüpgraded om duizenden genen tegelijk te bewerken, blijkt uit onderzoek gepubliceerd door het tijdschrift BioNews.

Aanvullende rapportage door Alina Bradford, medewerker.

Aanvullende bronnen

• Broad Institute: een tijdlijn van cruciaal werk aan CRISPR
• Nieuws over genetische manipulatie en biotechnologie: CRISPR-Cas9 10000-voudig verbeterd door synthetische nucleotiden
• Broad Institute: vragen en antwoorden over CRISPR